Zece noi genomuri mitocondriale complete ale pulmonatelor (Mollusca: Gastropoda) si impactul lor asupra relatiilor filogenetice

fundal

Reconstruirea relatiilor superioare ale gastropodelor pulmonare a fost dificila. Utilizarea morfologiei este problematica datorita omoplaziei ridicate. Studiile moleculare au suferit de prelevare de taxon scazuta. Patruzeci si opt de genome mitocondriale complete sunt disponibile pentru gastropode, zece dintre ele fiind pulmonate. Aici sunt prezentate genomele mitocondriale complete ale celor zece specii urmatoare de pulmonate : Rhamphidia Salinator (Amphiboloidea); Auriculinella bidentata, Myosotella myosotis, Ovatella vulcani si Pedipes pedipes ( Ellobiidae ); Peronia peronii ( Onchidiidae ); Siphonaria gigas (Siphonariidae); Succinea putris (Stylommatophora); Trimusculus reticulatus(Trimusculidae); si Rhopalocaulis grandidieri (Veronicellidae). De asemenea, sunt furnizate 94 de primeri noi pentru pulmonat pe intregul genom mitocondrial, care au fost proiectate pentru amplificarea genomului mitocondrial intreg prin reactii scurte si lacunele de dupa secventarea puscarii.

Rezultate

Sunt furnizate caracteristicile structurale ale celor 10 noi genomuri mitocondriale. Toti genomii impartasesc ordine similare ale genelor. Analizele filogenetice au fost efectuate incluzand cei 10 noi genomi si 17 genomi de la Genbank (grupuri exterioare, opistobranchi si alte pulmonate). Analizele Bayesian Inference si Maximum Likelihood, bazate pe secventele de aminoacizi concatenate din cele 13 gene care codifica proteinele, au produs aceeasi topologie. Pulmonatii sunt parafiletici si bazali fata de opistobrancii care sunt monofiletici la varful copacului. Sifhonaria , considerata in mod traditional ca un pulmonat bazal, este cuibarita in opistobranchi. Pyramidella, considerat in mod traditional ca un heterobranch bazal (non-euthyneuran), este cuibat in pulmonate. Mai multe ipoteze sunt respinse, cum ar fi Systellommatophora, Geophila si Eupulmonata. Ellobiidae este polifiletic, dar Trimusculus reticulatus fals limpet este strans legat de unele ellobiide.

concluzii

In ciuda eforturilor recente de crestere a esantionarii de taxon in euthyneuran (opistobobchiuri si pulmonate) filogenii moleculare, mai multe dintre nodurile mai profunde sunt inca incerte, din cauza valorilor scazute de sprijin, precum si o oarecare incongruenta intre analizele bazate pe genomele mitocondriale complete si cele bazate pe gene individuale (18S, 28S, 16S, CO1). Genomii completi suplimentari sunt necesari pentru pulmonati (in special pentru Williamia, Otina si Smeagol), precum si heterobranchii bazali in stransa legatura cu eutineuranii. Cresterea numarului de markeri pentru filogenetica gastropod (si mai larg moluste) este, de asemenea, necesara pentru a rezolva unele dintre nodurile mai adanci, chiar daca in mod evident nu este o sarcina usoara. Pas cu pas, insa, se dezvaluie noi relatii, cum ar fi relatiile stranse dintre Trimusculus fals si ellobiidele, cuibarea piramidaleidelor in pulmonate si relatiile stranse ale Sifhonaria cu opistobobacurile sacoglossan . Genomele suplimentare prezentate aici arata ca unele specii au un ordin genic mitocondrial identic datorita convergentei.

Elucidarea relatiilor filogenetice superioare ale gastropodelor pulmonare a ramas dificila. O analiza filogenetica bazata pe morfologie a scos la iveala un nivel ridicat de omoplazie si a dus la un arbore slab rezolvat [1]. Studiile moleculare s-au bazat pe cateva gene individuale, in esenta date 18S, 28S, 16S si COI [2–5] sau pe putini genomi mitocondriici completi [6–8].

Analizele bazate pe secvente individuale de gene ofera toate relatii similare (Figura 1) [2–5]: pulmonatul este monofiletic, dar include cativa taxoni care nu sunt clasificati in mod traditional drept pulmonati (Acochlidia, considerata in mod traditional ca opistobobranchi, si Glacidorbidae si Pyramidelloidea, considerate in mod traditional ca heterobranchi bazali); de asemenea, opistobranch-urile sunt parafiletice, bazale pentru pulmonate; in sfarsit, falsul sarpe Sifhonaria , considerat in mod traditional ca un pulmonat , se dovedeste ca, in unele cazuri, este mai strans legat de opistobranchi decat pulmonii. In ultimii ani, esantionarea de taxon a crescut semnificativ in analizele care utilizeaza gene individuale: cel mai mare set de date (18S, 16S si COI) stabilit pana in prezent include 79 de specii reprezentand toti taxele majore de pulmonate [5].

Analizele bazate pe genomul mitocondrial complet asigura relatii filogenetice diferite, cel putin pentru nodurile profunde [6–8]: pulmonatul este parafiletic, bazal pentru opistobobacurile monofiletice; Siphonariaeste cuibarit in interiorul opistobranchilor. Esantionarea cu taxon este inca limitata in analizele bazate pe genomele mitocondriale complete, mai ales pentru ca genomii mitocondriali gastropodi sunt inca dificil de obtinut. De cand a fost publicat primul genom mitocondrial complet gastropod in 1995 [9], 48 de genomi completi au fost disponibili (figura 2). Utilizarea secventarii cu pusca si scaderea costurilor de secventare a determinat o crestere vizibila a productiei de genomi gastropod mitocondriali in urma cu cativa ani (Figura 2). Zece genomuri au devenit disponibile in noua publicatii diferite intre 1995 si 2006; din 2008, 38 de genomi au devenit disponibili, dintre care 30 au aparut in doar patru publicatii [6, 8, 10, 11], desi au fost publicate si cateva lucrari cu un singur genom.

In prezent, Opisthobranchia si Neogastropoda (una dintre liniile Caenogastropoda) sunt taxonii pentru care sunt disponibili cel mai mare numar de genomi mitocondriali complet, cu 17 si, respectiv, 12 genomi (Figura 2). Zece genomi sunt disponibili pentru pulmonate (inclusiv doua nepublicate), dar numai o parte din cladele pulmonate superioare sunt reprezentate. Prelevarea de taxon pentru ceilalti gastropodi este fie insuficienta (Patellogastropoda, Vetigastropoda, Neritimorpha, caenogastropode bazale si heterobranchi bazali) sau lipseste (Cocculiniformia).

In studiul de fata, raportam 10 noi genome mitocondriale complete, pulmonate , cu accent special pe linii care au fost esantionate slab sau care nu au fost esantionate (Figura 2, Tabelul 1): Salamator rhamphidia (Amphiboloidea); Auriculinella bidentata, Myosotella myosotis, Ovatella vulcani si Pedipes pedipes ( Ellobiidae ); Peronia peronii ( Onchidiidae ); Siphonaria gigas (Siphonariidae); Succinea putris (Stylommatophora); Trimusculus reticulatus (Trimusculidae); si Rhopalocaulis grandidieri(Veronicellidae). Aici oferim, de asemenea, un set de 94 de noi, primeri pulmonat-specific, care acopera intregul genom mitocondrial si special conceput pentru studiul de fata. Aceste noi primeruri au fost combinate in mai multe perechi sau cu 10 primer mitocondrial publicate anterior, pentru a amplifica genomii prin reactii simultane, scurte. Aceasta abordare directa a fost de mare ajutor pentru amplificarea genomilor mitocondriali in studiul de fata. Relatiile pulmonate sunt evaluate prin analize filogenetice pe baza acestor noi genomuri, precum si 17 genomi publicate anterior. Se discuta despre impactul acestui nou set de date asupra intelegerii noastre despre relatiile si evolutia pulmonatilor.

Caracteristici structurale ale genomului

Caracteristicile structurale ale fiecaruia dintre cei 10 genomi mitocondriali secventiati in acest studiu sunt rezumate in tabelul 2. Fiecare genom este format din 13 gene care codifica proteine, doua gene rARN si 22 gene ARNt. Genomii variaza ca marime de la 13, 968 bp ( Peronia peronii ) la 16, 708 pb ( Pedipes pedipes ), cu majoritatea in intervalul de 14 000 pb. In toate cele 10 genomuri, 13 din cele 37 de gene sunt codificate pe cablul minus: trnQ, trnL2, atp8, trnN, atp6, trnR, trnE, rrnS, trnM, nad3, trnS2, trnT si cox3 . In Succinea putris, trnY si trnW sunt, de asemenea, codificate pe linia minus, precum si trnH in Siphonaria gigas. In majoritatea genelor care codifica proteinele (59 din 130), codonul de inceput este TTG. Alternativ, codonul de pornire este fie ATG (43), GTG (17), ATT (6), ATA (3), CTG (1), fie TTA (1). Codonul stop este fie TAA (52), TAG (41), T (36), fie TA (1), niciunul nu este utilizat doar pentru o anumita gena care codifica proteine.

Toti cei 10 genomi mitocondriali au gene suprapuse adiacente, de obicei intre 11 si 12 gene; cel mai mare numar (15) de gene suprapuse se gaseste in Peronia peronii, iar cel mai putin numar (7) se gaseste la Pedipes pedipes , ceea ce este probabil corelat cu dimensiunea genomului. Cantitatea de suprapunere intre gene este de obicei intre 1 si 30 pb. Doar o pereche de gene care se suprapun este comuna la toate cele 10 genome mitocondriale: trnK, cox1 (5 pana la 8 pb). Cu exceptia pedipesului Pedipes , celelalte noua genomuri mitocondriale au toate suprapuneri nad6, nad5 (2 pana la 18 pb) si suprapuneri nad5, nad1 (14 pana la 26 pb). Cele mai mari suprapuneri din genele adiacente sunt de 39 CP intre nad2, trnKin Succinea putris si 45 bp intre nad4L, cob in Auriculinella bidentata . Numarul de distante intergenice variaza de la patru in Peronia peronii pana la 20 in Pedipes Pedipes . Marimea tipica a distantiatorilor intergenici variaza de la 1 la 80 pb. Un spacer intergenic mare (651 bp) se gaseste in Rhopalocaulis grandidieri intre trnS1, trnS2 si un alt (270 pb) in Ovatella vulcani intre trnM, nad3 . Dintre cele 20 distante intergenice gasite in pedipele Pedipes , cinci dintre ele sunt marite si bogate in AT: 288 bp intre nad6, nad5 , 447 bp intre trnS2, trnT, 397 bp intre cox3, trnQ , 700 bp intre trnR, trnS1 si 317 intre nad4, trnI . Un distantator intergenic bogat in AT intre cox3, trnI se gaseste in toate cele 10 genome mitocondriale, iar aceasta a fost determinata a fi originea potentiala a replicarii (POR), care concureaza cu descoperirile anterioare [6]. Datorita rearanjarilor genice, POR pentru pedipele Pedipes poate fi localizat intre cox3, trnQ (397 pb) sau intre nad4, trnI (317 pb). POR din Pedipes este probabil adiacent la inceputul cox3 din doua motive. In primul rand, procentul de A + T in cei 50 pb adiacenti cox3este mai mare decat cei 50 bp adiacenti trnI (62,0% si, respectiv, 58,8%). In al doilea rand, un POR adiacent cu cox3 a fost gasit anterior in alte genomuri mitocondriale gastropode [10].

Cele 22 de ARNt pentru fiecare dintre cei 10 genomi mitocondriali au fost usor localizate, cu exceptia trnS1 in Rhopalocaulis grandidieri . Spre deosebire de trnS1 din celelalte noua genome mitocondriale, secventa bucla anticodon este CTGCTAG in locul CTGCTAA tipic si exista doua deficiente de baza in bucla anticodon, care este, de asemenea, neobisnuit (regiune secventiata cu o acoperire 4X). Toate trnS1 si trnS2 genele lipseste tija DHU.

Filogenia moleculara

Arborii din analizele ML si Bayesian impartasesc topologii identice si lungimi de ramura similare si valori de sustinere a nodurilor (Figura 3). Pulmonatii formeaza o grupa paraphyletic la baza Euthyneura; Pyramidella dolabrata , considerata in mod traditional ca un heterobranch bazal extern Euthyneura, este cuibarita in pulmonate (parafiletice). Sifhonaria , privita in mod traditional ca un pulmonat bazal, este cuibarita in Opisthobranchia, care formeaza o grupare monofiletica derivata la varful arborelui euthyneuran. Balaia veronicelida Rhopalocaulis grandidieri este cea mai bazala specie a euteneuranilor, cu sustinerea nodului ridicat. Melci de apa dulce Biomphalaria glabrata si Radix balthicaformeaza o clada care apare imediat dupa Rhopalocaulis grandidieri . Melcii de pamant Succinea putris si Albinaria coerulea formeaza o clada care apare imediat dupa melcii de apa dulce. Ellobiidele ( Pedipes pedipes, Myosotella myosotis, Ovatella vulcani si Auriculinella bidentata ) nu sunt monofiletice si sunt raspandite in toata portiunea bazala a copacului. Cu toate acestea, Trimusculus reticulatus fals (Trimusculidae) este recuperat ca fiind strans legat de doua ellobiide ( Ovatella vulcani si Auriculinella bidentata ), care este puternic sustinut. Cele trei specii de onchidiide ( Peronia peronii, Onchidella borealis siOnchidella celtica ) formeaza o grupare monofiletica foarte sustinuta. Rhamphidia salinator (Amphiboloidea), considerata in mod traditional ca un pulmonat bazal (in principal din cauza prezentei unui operculum), nu este bazala in ceea ce priveste toti pulmonii. In cadrul cladei Opisthobranchia, Ascobulla fragilis este cel mai bazal. Testele AU si SH efectuate indica faptul ca alte ipoteze alternative ale monofiliei (Eupulmonata, Geophila, Ellobiidae si Systellommatophora) sunt respinse (tabelul 3).

Unele noduri sunt puternic sustinute, cu probabilitati posterioare bayesiene de 1 si valori de bootstrap de 100%, cum ar fi monofilia opistobranchilor (inclusiv Siphonaria ) si monofilia cladei incluzand Trimusculus si doi ellobiizi ( Ovatella si Auriculinella). Unele alte noduri sunt inca sustinute in mod rezonabil, desi mai putin puternic, cu probabilitati posterioare bayesiene de 1 si valori de bootstrap superioare a 75%. Cu toate acestea, patru dintre nodurile mai profunde nu prezinta suport statistic, cu probabilitati posterioare bayesiene mai mici de 0,8 si valori de bootstrap mai mici de 50%. Aceste noduri, indicate ca linii subtiri in figura 3, ar trebui considerate polimii nerezolvate, ceea ce afecteaza in mod direct interpretarea relatiilor (vezi Discutia).

Organizare genomatica si rearanjari

Biomphalaria glabrata, Salinator rhamphidia, Trimusculus reticulatus, Ovatella vulcani, Auriculinella bidentata, Peronia peronii, Onchidella borealis, Onchidella celtica au o organizatie genomica mitocondriala identica (Figura 4). Albinaria coerulea impartaseste aceeasi organizatie a genomului, cu exceptia faptului ca pozitia trnS1 si trnS2 sunt comutate si trnS1 este inversat. Genomul celor doua melci de apa dulce Radix balthica si Biomphalaria glabrata difera in locatia a cinci ARNt ( P, H, G, C si Y ). Genomul Rhopalocaulis grandidieri difera de localizarea a sapte ARNt (C, F, G, W, H, L2 si E ). Genomul Succinea putris difera in locatia a trei ARNt-uri ( F, Y si W ), ultimele doua gene fiind codate pe catena minus in loc de catena plus. In Pedipes pedipes, trnT, cox3 swapped cu trnS1, nad4 , si trnQ si trnR s-au deplasat intre aceste doua seturi de gene schimbate.

Array

Myosotella myosotis difera doar de cea mai standard organizare a genomului mitocondrial prin rearanjarea nad4L intre cox2 si trnY . Locatia trnY inaintecox1 este o caracteristica unica si neobisnuita a genomului mitocondrial al Pyramidella dolabrata . Alte atribute, cum ar fi localizarea atp6 inainte de atp8 si codificarea trnG de cablul minus, sunt exclusive pentru Pyramidella dolabrata .

Genomii opistobranch difera doar de aranjamentul comun al genomului mitocondrial in pozitia trnY, trnW si trnC . TRNC este situat intre trnH si trnQ in fragilis Ascobulla, Chromodoris Magnifica si Berthellina ilisima si intre trnN si atp6 in Aplysia californica, Pupa strigosa si Hydatina physis . Organizarea genomului Sifhonaria gigas este mai similara cu genomul opistobobranchilor decat al pulmonatelor, ceea ce este valabil si pentru Siphonaria pectinatain ciuda unor rearanjari moderate (de exemplu, trnY si trnW sunt adiacente la nad4L ).

Diversitatea speciilor gastropodelor pulmonare este dominata in mare parte de melcii si balci de pamant, sau Stylommatophora, care includ cel putin 25 000 de specii. Cu toate acestea, mai putin de cinci la suta din diversitatea speciilor pulmonate se regaseste in celelalte zece taxone superioare, care sunt anatomice si ecologice foarte distincte intre ele: Amphiboloidea, Ellobiidae, Hygrophila, Onchidiidae, Otinidae, Siphonariidae, Smeagolidae, Trimusculidae, Veronicellidae si Williamiidae. Prezenta contributie constituie o crestere semnificativa a esantionarii de taxon pentru genomul mitocondrial complet al pulmonatelor, in special in ceea ce priveste taxonii non-stilomatoforani (figura 2, tabelul 1): genomuri mitocondriale complete de amfiboloide, trimusculide, veronicellide si doua „subfamilii” ellobiide (Pedipedinae) si Ellobiinae) sunt prezentate aici pentru prima data.

Topologia arborelui consens produs prin analizele noastre filogenetice (Figura 3) este foarte asemanatoare cu arborii obtinuti anterior pe baza tuturor genelor codificatoare de proteine ​​ale genomilor mitocondriului [6, 7]: pulmonatele sunt parafiletice, la baza eutineuranilor ( opistobranchi si pulmonate); opistobobacurile (inclusiv Sifhonaria ) sunt monofiletice, in varful copacului. Pyramidella dolabrata , considerata in mod traditional ca un heterobranch bazal (in afara eutineuranilor), este mai strans legata de pulmonate. Biomphalaria glabrata se gaseste aici la baza pulmonatelor [7] in loc de o pozitie mai derivata in copac [6].

Copacii bazati pe genomii mitocondriali (figura 3) prezinta o oarecare congruenta cu arborii bazati pe gene individuale -18S, 28S, 16S, COI (Figura 1). In special, ambele seturi de date sunt de acord asupra anumitor noduri care nu au fost suspectate anterior, precum relatia stransa cu Trimusculus reticulatussi ellobiide. Cu toate acestea, ambele seturi de date prezinta si unele diferente notabile. Acest lucru se poate explica prin faptul ca unele dintre nodurile mai adanci sunt slab sustinute de setul de date mitocondriale AA prezentat aici (Figura 3). De asemenea, esantionarea de taxon difera foarte mult: aproape 80 de specii de pulmonate sunt incluse intr-o analiza recenta folosind secvente 18S, 16S si COI [5], in timp ce doar 20 de genomi mitocondriali completi ai pulmonatelor sunt disponibile, inclusiv cele generate in acest studiu. Mai jos vom discuta despre impactul rezultatelor noastre filogenetice asupra intelegerii noastre despre evolutia gastropodelor pulmonare. In special, ne concentram pe noile perspective si noile intrebari ridicate prin adaugarea celor 10 noi genomuri mitocondriale.

In rezultatele prezente, cea mai bazala linie a tuturor euthyneuranilor sunt terasele terestre, veronicelide, reprezentate aici de o singura specie, Rhopalocaulis grandidieri(Figura 3). In mod traditional, Veronicellidae a fost clasificat in Systellommatophora, alaturi de Onchidiidae si Rathouisiidae [12], desi nu s-au gasit sinapomorfii pentru sistellomatoforani in analize cladistice [1]. Reprezentarea veronicelidelor in analizele moleculare este recenta, dar arborii pe baza secventelor individuale de gene sustin monofilia Systellommatophora (Figura 1) [4, 5]. O pozitie bazala a veronicelidelor fata de alti pulmati a fost propusa pe baza morfologiei [13, 14]. Cu toate acestea, acest rezultat s-a bazat pe interpretari problematice ale anatomiei sistemelomatoforanelor, cum ar fi faptul ca ar fi lipsit de un pneumostom si de un plaman. Daca se confirma, o pozitie bazala a veronicelidelor ne-ar putea duce sa reinterpretam cavitatea lor paliala extrem de redusa. In orice caz,

Melcii de apa dulce (aici reprezentati de Radix balthica si Biomphalaria glabrata ) se gasesc printre cele mai bazale linii, desi relatiile lor cu Stylommatophora (reprezentate aici de Succinea putris si Albinaria coerulea ), nu sunt clare. Cu toate acestea, pozitia Hygrophila este inca destul de instabila si variaza de la un studiu la altul [2, 4, 5]. Din motive neclare, incercarile noastre de a obtine noi genomuri complete ale pulmonatelor de apa dulce au esuat (foarte putine PCR-uri au functionat), desi am inceput cu material proaspat din 13 specii).

O pozitie relativ bazala a Stylommatophora fata de alti pulmati a fost obtinuta in analizele anterioare bazate pe genomele mitocondriale si genele individuale (Figura 1) [5–7]. Multe caracteristici derivate caracterizeaza melcii si balciurile terestre, in special in sistemele excretorii si pulmonare, care sunt critice fiziologic pentru viata pe uscat [1, 12]. Drept urmare, melcii si labele de pamant au fost adesea considerate ca cele mai derivate – si deci cele mai recente – liniati de pulmonate. Cu toate acestea, multe dintre aceste caracteristici derivate sunt autapomorfe (de exemplu, anatomia ureterului) sau potential homoplasice (de exemplu, ochii in varful tentaculelor oculare) [1]. O pozitie bazala a melcilor si a slugilor de pamant sprijina teoria lui Solem conform careia stilomatoforanii au fost primii pulmonari care au aparut 350 Mya [5, 12].

Ellobiidae este un taxon divers, cu aproximativ 800 de nume de specii disponibile in literatura de specialitate, desi doar 250 dintre ele sunt probabil sa fie valabile. Mai important, Ellobiidae este filogenetic diferit, deoarece cele 24 de genuri ellobiide sunt caracterizate prin combinatii diferite de caractere plesiomorfe si derivate [15, 16]. Ca urmare, nu poate fi gasita o sinapomorfie morfologica exclusiva pentru ellobiide in contextul mai larg al tuturor pulmonatelor [1]. Timp de mai multi ani, analizele moleculare nu au putut testa in mod adecvat starea filogenetica a ellobiidelor din cauza prelevarii scazute a taxonului [2, 6]. Cu toate acestea, s-a constatat ca ellobiidii sunt monofilici intr-o analiza moleculara recenta bazata pe un nou set complet de date, inclusiv 25 de specii de ellobiide (Figura 1) [5],

Desi starea filogenetica a Ellobiidae ramane problematica, analizele bazate pe secvente AA concatenate mitocondriale si pe cele bazate pe gene individuale (18S, 28S, 16S, COI) sunt de acord cu faptul ca Trimusculus reticulatus este foarte strans legat de ellobiide (Figura 1) [2 -5]. Trimusculus reticulatus impartaseste, de asemenea, aceeasi organizare a genomului ca mai multe specii de ellobiide (figura 4). Acesta este un rezultat nou care nu a fost sugerat folosind morfologie. De fapt, nu exista nici o caracteristica anatomica evidenta care sa fie impartasita de Trimusculus si ellobiizi [5]. Unele caracteristici se gasesc in ellobiide si Trimusculus, dar se gasesc si in multe alte pulmonate, cum ar fi globineuronii si un sistem nervos central hipoathroid [1, 17]. Un alt rezultat interesant obtinut aici, precum si in analizele recente bazate pe gene individuale, este relatia stransa dintre Onchidiidae si unii ellobiizi (Figura 1). Onchidiidae si Ellobiidae au fost sugerate sa fie clasificate impreuna in Ellobioidea [18], partial bazate pe personaje din sistemul nervos.

Datele noastre actuale (tabelul 3) resping ipoteza Geophila (Systellommatophora si Stylommatophora), care nu este sustinuta si de alte date moleculare recente (Figura 1). Datele morfologice au sustinut monofilia lui Geophila, bazata in principal pe doua sinapomorfii, adica pierderea heterostrofiei si prezenta ochilor la varful tentaculelor oculare [1]. Ambele caracteristici ar fi putut evolua independent in Stylommatophora, Onchidiidae si Veronicellidae. Ipoteza Eupulmonata sensu Morton (Geophila si Ellobiidae) este, de asemenea, respinsa [15].

Analizele prezente confirma doua rezultate importante din studiile moleculare recente (Figura 1) [2–6]. In primul rand, Amfiboloidea, considerata in mod traditional ca una dintre cele mai bazale linii ale pulmonatelor, nu este bazala, ceea ce sugereaza ca operculul lor (amfiboloidele si glacidorbidele sunt singurele pulmonate cu un operculum) au fost obtinute secundar. In al doilea rand, piramidelloizii, considerati in mod traditional ca heterobranchi bazali (adica, neututneuran), sunt acum considerati in mod constant cuibiti in pulmonate [2-5, 19]. Cu toate acestea, piramidelloizii au fost intotdeauna dificil de clasificat. Unii autori din trecut i-au considerat chiar ca opistobranchi [20–23]. Faptul ca piramidele difera atat de mult de alti pulmati poate fi legat de faptul ca traiesc scufundate in apa de mare ( Williamiaspeciile sunt singurele alte pulmonate care traiesc scufundate ca adulti).

In sfarsit, datele prezente confirma faptul ca Sifhonaria este mai strans legata de opistobranchi decat de pulmonate, desi aceasta relatie este mult mai clara cu genomele mitocondriale decat cu genele individuale (18S, 28S, 16S si CO1) [2-6, 8]. Mai precis, Siphonaria pare sa fie cea mai stransa legatura cu sacoglossanii (aici reprezentati ca Ascobulla fragilis ). In cea mai mare parte a secolului XX, autorii au clasificat Siphonaria in Pulmonata, mai ales pentru ca au tendinta de a trai in zona intertidala superioara, expusa aerului in cea mai mare parte a zilei, spre deosebire de opistobranchiile, care toate traiesc scufundate chiar si atunci cand se gasesc in zona intertidala. . Ca urmare, cavitatea paliala a Sifhonariaa fost interpretat ca o cavitate pulmonara si branhii lor ca branhii secundare. Cu toate acestea, anatomistii timpurii au recunoscut asemanarea branhiei paliale a Sifhonaria cu cea a cefalaspideilor [24, 25], sugerand ca ar putea fi omologi [1, 26]. Gilialul palial al Sifhonaria a fost chiar uneori denumit branhial cefalaspidean [27]. Sifhonaria si opistobobacurile au o alta caracteristica importanta, adica producerea unei substante albe lactate (metaboliti polipropionat) cand este iritata [28], desi metabolitii defensivi se gasesc si in alti pulmonati , cum ar fi Onchidium ( Onchidiidae ) si Trimusculus [29]. Chiar si ordinea genica a genomului mitocondrial al Siphonaria gigas(a se vedea pozitia trnY, trnW, nad4L si cob ; Figura 4) sustine o afinitate cu opistobranchs.

Ordinea genelor care codifica proteine, ARNr si ARNt in genomele mitocondriale este cunoscuta a fi potential informativa pentru filogenetica [30]. Cu toate acestea, genomii gastropodilor pulmonari prezinta o variatie informationala limitata, deoarece organizarea genelor care codifica proteine ​​si ribozomale este stabila in intreaga eutineurana (figura 4). De asemenea, figura 3, care plaseaza ordinea genelor intr-un context filogenetic, sugereaza ca speciile pot impartasi aceeasi ordine genica din cauza convergentei. Intr-adevar, melcul de apa dulce Biomphalaria glabrata impartaseste aceeasi ordine genica ca si alte pulmonate inrudite la distanta reprezentate aici ( Salinator, Trimusculus, Ovatella, Auriculinella, Onchidella si Peronia ), dar difera de celelalte melc de apa dulce reprezentate aici,Radix balthica , pentru cinci gene de ARNt. Deci, ordinea genelor gasite in Biomphalaria glabrata si in alte pulmonate este probabil datorata convergentei, adica genele ARNt s-au incheiat in pozitii identice printr-o serie de rearanjari distincte, dar convergente. Faptul ca genomele celor doua specii Sifhonaria difera in ceea ce priveste pozitia a doua gene care codifica proteinele ( nad4 si nad4L ), care a fost observata in mod exceptional la eutinenerani, sustine aceeasi idee ca ordinea genica a genomului mitocondrial al unei specii date ar trebui probabil sa nu fie utilizat pentru a extrapola pe ordinea genica a unui intreg linie. In caenogastropode, Rawlings si colaboratorii au demonstrat, de asemenea, ca doua specii de Dendropom inrudite stranspoate diferi semnificativ in ceea ce priveste organizarea genomului [11]. Atunci cand genomele suplimentare sunt disponibile pentru fiecare linie majora de pulmonat (Veronicellidae, Hygrophila, Onchidiidae etc.), ar putea deveni posibil sa se determine o ordine genica comuna pentru fiecare linie, dar nu este posibila in acest stadiu din cauza numarului nostru inca limitat de genomuri complete. Cu toate acestea, nu exista nici o indoiala ca, pe masura ce genomul complet suplimentar devine disponibil in euteneurans, vom descoperi o variabilitate crescuta in ordinea genelor euthyneuran.

Datele prezente constituie o crestere semnificativa a esantionarii de taxon pentru genomii mitocondriali completa a pulmonatelor (figura 2). Cu toate acestea, in ciuda acestor eforturi, suntem inca departe de o intelegere cuprinzatoare a relatiilor superioare ale pulmonilor. Majoritatea nodurilor profunde sunt inca incerte, in principal din cauza valorilor scazute de suport, precum si a unei anumite incongruente intre analizele bazate pe diferite seturi de date ( genomele mitocondriale complete fata de genele individuale -18S, 28S, 16S, CO1), aceste doua probleme fiind in mod evident legate. (Figurile 1, 3). Sunt necesari genomi pulmonari suplimentari, in special pentru taxonii pentru care nu este disponibil in prezent un genom ( Williamia, Otina si Smeagol). Relatiile euthyneurane ar beneficia, de asemenea, foarte mult de adaugarea de noi genomuri de heterobranchi bazali (Architectonicoidea, Valvatoidea, Omalogroidea, Rissoelloidea, Orbitestellidae). Fiind taxonii cei mai strans legati de euteneurani, heterobranchii bazali ar putea ajuta la stabilizarea topologiei in interiorul eutineuranilor.

Filogenetica euteneurana si, mai pe larg, filogenetica moluscana se bazeaza in continuare pe date limitate, cel putin in comparatie cu studiile filogenetice cu vertebrate sau artropode care pot include mai mult de 40 kb de date de secventa. Abordarea unora dintre incongruenta dintre copaci bazata pe gene individuale (18S, 28S, 16S, CO1) si cele bazate pe genomuri mitocondriale complete din filogenetica eutneurana este un obiectiv pe termen lung care nu depaseste scopul studiului de fata. Progresul va necesita, evident, o esantionare crescuta a taxonului, dar, mai important, noi markeri, mai ales avand in vedere ca, in unele moduri, utilizarea genomelor mitocondriale este similara cu analizarea unui marker cu multi loci [5]. In viitor, cand numarul si diversitatea secventelor moleculare si a probelor de taxon sunt crescute,

Intre timp, trebuie sa acceptam ca progresul nostru in ceea ce priveste filogenetica euteneurana va fi lent. Pas cu pas, se fac descoperiri importante (figurile 1 si 3). Unele dintre rezultatele obtinute din studiile moleculare recente constituie descoperiri majore noi [2–5]. In special, toate seturile de date sustin relatii stranse intre Trimusculus reticulatus si ellobiide. De asemenea, piramidelloizii, considerati timp de mai multe decenii drept heterobranchi bazali (non-euthyneuran), se cuibaresc in pulmonate. In sfarsit, falsele suvite Sifhonaria , considerate in mod traditional ca pulmonate , sunt strans legate de opistobobacurile sacoglossanului; genomii mitocondriali sugereaza puternic ca Siphonariaeste cuibarit in Opisthobranchia monofiletica (Figura 3), in timp ce genele individuale sugereaza ca Sifhonaria si sacoglossanii ar putea fi la baza Pulmonatei monofiletice (Figura 1). Toate aceste rezultate consolideaza ideea ca opistobobacul si filogenetica pulmonata si evolutia ar trebui studiate impreuna, ca euteneurani [1, 26].

Prelevare de taxon

In plus fata de cele zece genome mitocondriale secventiate cu succes pentru studiul de fata, analizele noastre includ, de asemenea, 17 genomi mitocondriali completi de gastropode obtinute de la GenBank (tabelul 1). Dintre cei zece genomi mitocondriali de pulmonati disponibili (figura 2), trei nu au fost selectati aici: secventa Cepaea nemoralis , generata cu mai mult de 15 ani, este de calitate slaba; genomul mitocondrial al Biomphalaria tenagophila si Platevindex mortoni, desi sunt disponibile public in Genbank, sunt inca nepublicate si ar trebui publicate in scurt timp de catre autorii lor. In plus, sapte genomi au fost selectati pentru a reprezenta principalele linii ale opistobobranchilor (Anaspidea, Cephalaspidea, Notaspidea, Nudibranchia si Sacoglossa). Trei grupuri au fost selectate in cadrul Caenogastropoda.

Identificarea speciilor, Tichetele si extragerea ADN-ului

Speciile pentru care au fost obtinute genomuri in prezentul studiu au fost identificate de catre experti taxonomice (unii dintre care sunt co-autori ai prezentului articol): Rosemary Golding a identificat Salinator , Suzete Gomes Rhopalocaulis , Antonio M. de Frias Martins de ellobiids, Tracy Alb Siphonaria , si Benoit Dayrat Peronia, Succinea si Trimusculus . Exemplarele de bonuri sunt depuse in colectiile muzeului (tabelul 1). Pentru fiecare specie, genomul mitocondrial complet a fost obtinut de la un singur individ (cu exceptia micilor Pedipes Pedipespentru care trebuiau folositi trei indivizi). In cele mai multe cazuri, persoana respectiva face parte din lotul depus ca bon.

• liveinfoinfo2.cavandoragh.org
• toploveland3.simplesite.com
• realcoachlist5.my-free.website
• www.bookmarking-presto.win
• greeninfopoint2.mystrikingly.com
• distributors.maitredpos.com
• www.bookmarkzoo.win
• taxibestellung24.de
• goinfotalk2.timeforchangecounselling.com
• www.sa-live.com
• frienddo.com
• blogfreely.net
• goloveclub6.mystrikingly.com
• ezproxy.cityu.edu.hk
• worldcoachsite5.tumblr.com
• www.ybcxz.com
• www.ready-bookmarks.win
• storeboard.com
• www.gurufocus.com
• sfwater.org

Cu toate acestea, exemplarul mic utilizat pentru extractia ADN-ului Salinatorului, Auriculinella si Ovatella a trebuit sa fie distrus. In aceste cazuri, lotul voucher contine alte persoane din aceeasi populatie. ADN-ul a fost extras folosind protocolul de extractie al fenol-cloroformului cu bromura de cetiltrimetil-amoniu (CTAB) [31].

Amplificare si secventare PCR

Au fost combinate trei abordari pentru a obtine cu succes genomii mitocondriale complete (fisier aditional 1): 1) produsele PCR lungi (de la ~ 3 pana la 10 kb) au fost amplificate si secventiate folosind secventarea pusca; 2) produsele PCR scurte (mai mici de ~ 1,5 kb) au fost amplificate utilizand primerii specifici pulmonatului care se intind pe intregul genom si au fost proiectate special pentru studiul prezent (primeri specifici pulmonat au fost proiectati prin alinierea tuturor secventelor genomelor mitocondriale pulmonare disponibile atunci cand a inceput studiul prezent); 3) produsele PCR scurte au fost amplificate prin „mersul grundului”, adica folosind primerii specifici individuali proiectati in regiuni secventate anterior (prin grund specific pentru individ, inseamna ca primeri diferiti au fost proiectati pentru fiecare genom care a fost secventiat). Acoperirea de secventa a variat de la 2X (secvente de la primerii pulmonari si specifici individuali) la mai mult de 20X (secvente din secventarea cu pusca a PCR-urilor lungi). Doar cromatograme de inalta calitate au fost utilizate in zonele in care acoperirea secventei a fost de 2X. Dosarul aditional 1 rezuma modul in care aceste trei abordari au fost combinate pentru a obtine fiecare genom.

Amplificare PCR lunga

Cinci perechi de primeri universali au fost utilizati pentru a genera produse PCR scurte in cinci gene mitocondriale: cox1, cox3, cob, rrnS si rrnL [32]. Pentru a creste succesul amplificarii PCR indelungate, primerii specifici individuali au fost proiectati in fragmentele scurte de PCR ale cox1, cox3, cob, rrnS si rrnLobtinut cu primeri universali. Diferite combinatii de primeri specifici individuali au fost apoi folositi pentru a amplifica regiuni mari ale genomului (de la ~ 3 pana la 10 kb). In unele cazuri, primerii universali au fost combinati cu primerii specifici individual (combinatiile a doi primeri universali au dat foarte rar amplificari de succes). Reactiile PCR scurte de 25 µl au continut 10,9 µl de apa, 2,5 µl de 10X PCR tampon, 2 µl de 25 mM MgCl2, 1 µl din fiecare grund de 10 μM, 2 µl de amestec dNTP, 0,2 µl (1 unitate) de TaKaRa Taq ( Cod nr. R001A), 5 µl de ADN sablon 20 ng / μl si 0,4 µl de 100X BSA (10 mg / ml Album Seric Bovin). In unele reactii de PCR scurte, BSA a fost inlocuita cu 5 µl de solutie Qiagen QX 5X (apa adaugata la aceste reactii a fost de 6,3 µl). Termoprofilul folosit pentru cox3, cob si rrnSa fost cinci minute la 94 ° C; 40 de cicluri de 40 de secunde la 94 ° C, 1 minut la 46 ° C si 1 minut la 72 ° C; si 10 minute la 72 ° C. Termoprofilul utilizat pentru cox1 si rrnLa fost cinci minute la 94 ° C; 30 de cicluri de 40 de secunde la 94 ° C, 1 minut la 46 ° C si 1 minut la 72 ° C; si 10 minute la 72 ° C. Reactiile PCR lungi de 25 µl au continut 3,8 µl de apa, 2,5 µl de 10X LA PCR-tampon II, 0,5 µl de 25 mM MgCl2, 5 µl din fiecare grund de 2 μM, 3 µl de amestec dNTP, 0,2 µl (1 unitate) de TaKaRa LA Taq (cod nr. RR002M) si 5 pL de 20 ng / µl sablon ADN. Profilul termociclelor pentru PCR-urile lungi a constat intr-un minut la 98 ° C, urmat de 30 de cicluri de 98 ° C timp de 10 secunde si 68 ° C timp de 15 minute, cu o prelungire finala de 10 minute la 72 ° C. Toate produsele PCR lungi si scurte au fost curatate cu Qiagen QIAquick PCR Kit de purificare (Cat. Nr. 28106) inainte de secventiere.

Secventializare a pistolelor pentru produse PCR lungi

Produsele PCR indelungate purificate au fost taiate prin utilizarea HydroShear de la GeneMachines. ADN-ul taiat a fost apoi reparat la capat si vizualizat pe un gel de agaroza 1% colorat cu bromura de etidiu. Fragmente de gel de dimensiunea corecta (~ 250bp) au fost excizate si purificate din gel. Fragmentele de ADN reparate au fost apoi legate in plasmida vector pmcl si transformate in Escherichia coli competentecelule prin electroporare. Celulele au fost apoi ecranate albastru / alb pe placi de agar si au fost alese 96 de colonii albe pentru a forma fiecare biblioteca clona. O selectie aleatorie a bibliotecii a fost apoi amplificata de PCR pentru a asigura prezenta insertiei de ADN. Bibliotecile au fost secventiate la Institutul Joint Genome (JGI), Walnut Creek, California, in contextul unui curs de Genomica predat de dr. Monica Medina, in colaborare intre Universitatea din California, la Merced si JGI.

Amplificare scurta a PCR (specifica pulmonatului)

Un singur genom a fost secventiat in totalitatea sa folosind doar secventare PCR lunga si pusca ( Trimusculus reticulatus ; vezi fisul aditional 1). Pentru alti sase genomi, PCR si secventarea cu pusca lunga au dat genomuri partiale cu lacune de diferite dimensiuni care trebuiau inchise. Au fost proiectate un set de 94 primeri specifici pulmonatului (fisier aditional 2) pentru a inchide aceste goluri din cele sase genomuri partiale mitocondriale obtinute prin secventarea puscarii. Mai multe combinatii de primeri specifici pulmonat au fost folositi pentru a amplifica lacunele genomilor partiali obtinuti din secventarea puscasului. Aceste combinatii au fost, de asemenea, utilizate pentru a amplifica genomii speciilor fara a trece prin secventarea puscarii (a se vedea, fisierul suplimentar 1). In unele cazuri, in functie de suvita utilizata pentru transcriere, o combinatie de doi primeri inainte (de exNad4 -879F si Cox3 -164F) sau doi primeri inversa (de exemplu Nad3 -128R si Nad4 -642R) au trebuit sa fie utilizati. Pentru unii indivizi (ex. Salinator rhamphidia si Rhopalocaulis grandidieri), produsul PCR lung a fost utilizat ca sablon pentru amplificare in locul ADN-ului genomic (pentru sansele crescute de amplificare reusita). Pentru acele PCR-uri care vizeaza goluri de ~ 900 bp sau mai mari, a fost utilizata reactia PCR si termoprofilul lung (a se vedea mai sus). Au fost utilizate reactii scurte de PCR (vezi mai sus) pentru goluri mai mici de 900 bp cu urmatorul termoprofil: doua minute la 94 ° C; 5 cicluri de 40 de secunde la 94 ° C, 45 secunde la 45 ° C si 1 minut la 72 ° C; 30 de cicluri de 40 de secunde la 94 ° C, 40 secunde la 55 ° C si 1 minut la 72 ° C; si 3 minute la 72 ° C. Produsele PCR au fost curatate fie cu kitul de purificare Qiagen QIAquick PCR, fie cu ExoSAP (2 µl de 1u / μl Fofata alcalina de creveti, 0,1 µl de 20u / μl Exonucleaza I si 6 µl de apa la 4 µl de produs PCR) si trimise pentru secventiere .

Amplificare scurta (individuala) a PCR

Pentru golurile care au ramas in genomele mitocondriale dupa utilizarea primerilor specifici pulmonatului si a secventierii puscarii, primeri specifici individuali au fost proiectati si golurile au fost parcurse pana la final pana la finalizarea genomului (fisier aditional 1). In unele cazuri, a fost utilizata o combinatie intre un primer specific pulmonar si un primer specific individual in incercarea de a inchide golurile. Conditiile PCR pentru primerii specifici individual au fost identice cu cele utilizate pentru primerii specifici pulmonatului.

Adunarea si adnotarea genomului

Cromatogramele secventei de pusca produse de JGI au fost citite, s-au numit baze si s-a atribuit o valoare calitatii bazelor apelate prin programul Phred [33]. Secventele individuale au fost asamblate in contiguri folosind Phrap http://www.phrap.org. Contigurile create de Phrap au fost analizate si asamblate pentru a forma contiguri mai lungi si mai complete folosind Consed [34]. Secventele contig din secventarea puscarii au fost salvate in MacVector cu Assembler 9.5.2 http://www.macvector.com. Toate celelalte secvente (adica toate secventele care nu sunt obtinute prin secventiere la JGI; vezi fisierul suplimentar 1) au fost asamblate in MacVector.

Cadrele de lectura deschise (ORF) ale contigurilor asamblate au fost analizate de MacVector si identitatea tentativa a fiecarei gene care codifica proteine ​​a fost determinata pe baza hartii genomului mitocondrial al Aplysia dactylomela . Fiecare gena a fost adaugata la fisierul sau corespunzator Se-Al v2.0a11 http://evolve.zoo.ox.ac.uk care contine alinierea mai multor secvente de gastropode omologe, iar gena a fost demarcata pe genom pe baza rezultatelor alinierii. . Limitele atat ale genelor care codifica proteina, cat si ale ARN-ului au fost ajustate manual pe baza localizarii genelor adiacente. Toate genele ARNt au fost localizate manual, pe baza anticodonului si a secventei buclei si a buclei anticodon destul de bine conservate.

Analize filogenetice

Cele 13 secvente de gene care codifica proteine ​​au fost traduse mai intai in secvente de aminoacizi si apoi aliniate individual utilizand parametrii impliciti ai ClustalW (1.6) in versiunea MEGA 4.1 (Beta) [35]. Fiecare aliniere a fost decupata pentru a elimina variatia de pe ambele capete si apoi secventele au fost concatenate. Alinierea genelor concatenate care codifica proteinele (3, 458 aminoacizi) a fost ajustata manual si un numar minim de site-uri au fost apoi eliminate (lacune create prin insertii in secventele grupurilor de caenogastropode). Trei specii de caenogastropode au fost utilizate ca grupuri: Cymatium parthenopeum, Ilyanassa obsoleta si Lophiotoma cerithiformis (Tabelul 1).

Deoarece genele mitocondriale animale sunt in evolutie rapida [36–38], analizele filogenetice bazate pe secvente de aminoacizi sunt de obicei preferate analizelor bazate pe secvente de nucleotide [6, 7, 39]. De asemenea, s-a demonstrat ca genele individuale ofera o rezolutie topologica mai mica decat genele concatenate [10].

Modelul de substitutie a aminoacizilor a fost determinat a fi MTRev + I + G folosind criteriul Akaike Information (AIC) in versiunea Topali 2.5 [40]. Acelasi model a fost obtinut daca fiecare gena a fost tratata independent ca o partitie distincta, sau toate genele au fost concatenate intr-un singur set de date. Analiza probabilitatii maxime a aminoacidului a fost efectuata folosind modelul MTRev + I + G cu PhyML in Topali, cu valori de suport pentru bootstrap bazate pe 1000 de replici. O analiza ML alternativa a fost, de asemenea, efectuata in RAxML [41] folosind MTzoa [42], un model special conceput pentru seturile de date mitocondriale lophotrochozoan. Analiza lantului markovian cuplat cu Metropolis Bayesian Monte Carlo (MCMC) a fost efectuata pe secventele de aminoacizi folosind modelul MTRev + I + G cu MrBayes in interfata Topali (doua analize paralele, 100 de milioane de generatii, esantionate la fiecare 100 de generatii, 25% ardere -in). O analiza Bayesiana alternativa a fost realizata folosind modelul MTzoa. Instrumentul grafic Tracer v1.4 [43] a fost utilizat pentru a vizualiza convergenta lanturilor din analizele bayesiene. In plus, au fost comparate esantioane posterioare din diferite (cinci) rulaje, ceea ce este probabil cea mai buna abordare pentru a detecta problemele potentiale ale convergentei in lant [44].

Relatiile filogenetice alternative au fost testate cu testele Aproximativ nepartinitoare (AU) si Shimodaira-Hasegawa (SH), folosind CONSEL [45] folosind setarile implicite. Relatiile alternative s-au bazat pe rezultate traditionale, bazate pe morfologie, precum si pe rezultate moleculare recente [1, 5, 26].