Mecanisme genomice pentru toleranta la rece si producerea de exopolizaharide in cianobacteriul arctic Phormidesmis sacerdot BCI401

fundal

Cianobacteriile sunt principalii producatori primari in ecosistemele la rece extrem. Multe linii de cianobacterii prospera in aceste medii dure, dar nu se intelege pe deplin cum supravietuiesc in aceste conditii si daca au evoluat mecanisme specifice de adaptare la frig. Phormidesmis priestleyi este un cianobacterium care se gaseste in toata biosfera rece (habitatele arctice, antarctice si alpine). Secventierea genomica a P. sacerdot BC1401, un izolat dintr-o gaura de crioconit de pe gheata Groenlandei, a permis examinarea genelor implicate in raspunsul la soc la rece si producerea de substante polimerice extracelulare (EPS). Este posibil ca EPS-urile sa permita cianobacteriilor sa tamponeze efectele frigului extrem si prin identificarea mecanismelor de productie de EPS in P. sacerdoti BC1401 acest studiu stabileste calea pentru investigarea transcriptiei si a reglarii productiei de EPS intr-un cianobacterium tolerant la rece ecologic.

Rezultate

Am secventiat genomul proiect al P. sacerdot BC1401 si am implementat o noua abordare de vizualizare a graficului de Bruijn combinata cu analiza BLAST pentru a separa contigii cianobacterieni de un metagenom simplu generat din culturi non-axenice. Comparatia genelor de adaptare la frig cunoscute in P. sacerdot BC1401 cu trei rude din alte medii nu a evidentiat diferente clare intre linii. Genele implicate in biosinteza EPS au fost identificate din caile Wzy si ABC dependente. Numarul de gene implicate in biogeneza membranei celulare si a membranei in P. sacerdotiBC1401 au fost tipice in raport cu dimensiunea genomului. Un grup de gene implicat in formarea biofilmului a fost gasit omolog la sistemul Wps, desi caile de semnalizare intracelulara prin care acest lucru ar putea fi reglementat raman neclare.

concluzii

Rezultatele arata ca caracteristicile si complementul genomic al genelor cunoscute de soc rece din P. sacerdot BC1401 sunt comparabile cu linii conexe dintr-o mare varietate de habitate, desi inca pot exista gene de soc rece la acest organism. Productia EPS de P. sacerdot BC1401 contribuie probabil la capacitatea sa de a supravietui eficient in medii reci, totusi acest mecanism este distribuit pe scara larga in filonul cianobacterian. Descoperirea modului in care aceste mecanisme legate de EPS sunt reglementate poate ajuta la explicarea motivului pentru care P. priestleyi BC1401 are atat de mare succes in medii reci in care nu exista linii conexe.

Cianobacteriile sunt procariote fotosintetice care au prosperat pe planeta noastra pentru cel putin 2,33-2,4 Ga [1, 2]. In crio-cianobacterii sunt mari producatori primari care se gasesc in multe tipuri de habitate (de exemplu, lacuri, substraturi litice si crioconite [3]), unde presiunile potentiale de mediu includ expunerea la niveluri ridicate de radiatii ultraviolete in timpul verii, absenta completa de lumina in timpul iernii la polonezi, disponibilitate limitata de nutrienti, cicluri rapide de inghet-dezghet si activitate scazuta a apei [4].

Microorganismele (inclusiv bacteriile, arhaea si eucariote unicelulare) au numeroase adaptari care le permit sa supravietuiasca la temperaturi scazute. Exista mecanisme generice de soc rece (multe dintre ele s-au caracterizat in mezofile precum Escherichia coli ) care sunt responsabile pentru mentinerea fluiditatii membranei celulare, destabilizarea structurilor secundare ale acidului nucleic si contribuind la mentinerea structurii cromozomilor in conditii reci (analizate in Barria si colab. [ 5]). Alte mecanisme care au fost propuse includ productia de exopolizaharide (EPS), care joaca un rol major in protectia impotriva mediilor reci extreme (de exemplu, Bacterii: Colwellia psychrerythraea 34H [6], Pseudomonas sp. ID1 [7] si Pseudoalteromonassp. SM20310 [8]; Archaea: Methanococcoides burtonii si Halorubrum lacusprofundi [9]; Diatomee: Synedropsis sp., Fragilariopsis curta si F. Cylindrus [10]. In cianobacterii, se stie ca EPS-urile permit rezistenta la desicare in habitatele aride [11-13] si contribuie la formarea biofilmului [14, 15]. In medii reci, EPS-urile pot juca un rol in toleranta la dezghet [12, 13]. EPS-urile furnizeaza probabil un loc pentru localizarea compusilor protectori ultraviolete precum scytonemin si aminoacizi similari micosporinei (MAAs) si permit eliminarea cationilor metalici in conditii oligotrofice [16]. EPS-urile servesc, de asemenea, ca sursa de carbon pentru panza microbiana [17–19].

In timp ce toate aceste mecanisme pot fi gasite in majoritatea procariotelor, se intelege putin despre modul in care acestea pot diferi in cianobacterii de mediile reci in comparatie cu rudele lor temperate. Multe cianobacterii intalnite frecvent in criosfera se gasesc si intr-o varietate de habitate diverse (de exemplu, deserturi: Chroococcidiopsis [20] si Nostoc [21]; pesteri: Chroococcidiopsis , Nostoc , Phormidium , Leptolyngbya si Pseudanabaena [22]; cruste de sol: Phormidium , Leptolyngbya si Pseudanabaena[23]) unde persistenta lor se datoreaza unei rezistente nespecifice in medii extreme. Unele linii par mai localizate in criosfera si, ca atare, pot fi mai specializate pentru a supravietui la frig. Un astfel de organism este cianobacteriile filamentoase non-heterocistice producatoare de EPS Phormidesmis sacerdoti . Analiza secventelor de gene rRNA ale subunitatii mici (SSU) a aratat ca P. priestleyi poate fi gasit in toata criosfera globala [24, 25]. Analizele evolutiei trasaturilor au prezis ca P. priestleyi a avut un stramos tolerant la rece [25].

In Antarctica, P. priestleyi creste in mod obisnuit in regiunile dezglaciate, unde se gaseste de obicei asociata cu apa in miscare si scurgerea glaciara [26]. In regiunile arctice si alpine P. sacerdotiiSecventele de gene rRNA ale SSU au fost recuperate din gheata de suprafata pe ghetarii din Svalbard [27], lacurile oligotrofe din Pirinei [28], ghetarii de pe platoul tibetan [29] si lacurile de topit pe rafturile de gheata din Inalta Arctica canadiana [24]. Pe foaia de gheata din Groenlanda (GrIS) se gaseste in gauri de crioconit; topiti bazine de apa de pe suprafata ghetarilor formati de albedo local redus care contin particule anorganice si organice [30]. Filamentele cianobacteriene constituie o proportie mare de materie organica prezenta in granulele de crioconit si se crede ca cianobacteriile ajuta la medierea formarii crioconitei prin agregarea de particule [31, 32] influentand astfel direct „biocryomorfologia” suprafetelor de gheata [33]. .

In acest studiu am secventiat genomul P. sacerdot BC1401 folosind un vizualizator de ansamblu grafic de Bruijn dezvoltat recent pentru a elimina secventele non-cianobacteriene din ansamblu. Am utilizat analize BLAST pentru a investiga prezenta genelor cunoscute legate de stresul rece la acest gen si in stransele genomuri. Am identificat gene pentru mecanisme putative responsabile de reglarea, producerea si exportul polizaharidelor folosind cautari de domenii BLAST si Pfam. P. priestleyi BC1401 este primul genom al proiectului publicat al unui cianobacterium izolat din criosfera.

Materialul crioconit a fost colectat in vara anului 2014 de la statia meteo S6 a Universitatii din Utrecht din GrIS (67 ° 04 ′ N, 49 ° 23 ′ W) ~ 1000 m deasupra nivelului marii si ~ 30 km de marja de gheata, inainte fiind transportat inapoi la Bristol intr-un recipient refrigerat (~ 2-4 ° C). In laborator, cantitati mici de crioconit au fost transferate in petri vasele de lichid steril BG-11 [34] si au fost incubate la 4 ° C timp de 4-6 saptamani.

Culturile axenice au fost utilizate in mod obisnuit pentru secventializarea tulpinilor unice de cianobacterii. Cu toate acestea, mai multe probleme sunt asociate cu aceasta abordare. In primul rand, anumite tulpini pot depinde de biota lor comensala pentru o crestere reusita, de exemplu datorita utilizarii metabolitilor secundari [35]. In al doilea rand, procesul este intensiv in munca si greu de inclus in cadrul unui program de cercetare la scara mica. In cele din urma, culturile vor suferi multe generatii in timpul procesului de crestere si purificare; acest lucru ar putea duce la o divergenta moleculara semnificativa a tulpinilor cultivate de organismele de tip salbatic. Metodele prezentate aici au permis secventializarea unei tulpini unialgale impreuna cu microbiota comensala cu eliminarea cu succes a secventelor contaminante (non-cianobacterii) in timpul procesului de asamblare. Pentru a obtine tulpini unialgice, filamentele cianobacteriene individuale au fost separate folosind un microscop si un ac de sticla, transferate in tuburi de cultura care contin lichid steril BG-11 si incubate la 15 ° C. Dupa alte 4–6 saptamani, o cultura de succes a fost transferata in petri vasele de lichid steril BG-11 si a crescut la 4 ° C pana cand a fost disponibila suficienta biomasa pentru a extrage ADNc. Celulele recoltate au fost depozitate in tuburi sterile de 1,5 ml la -20 ° C.

DNA extraction and sequencing

Extragerea ADN-ului din cianobacterii poate fi adesea inhibata de prezenta EPSs si a peretilor celulari grosi. Pentru a rezolva aceasta problema, am folosit o metoda simpla de liza chimica / mecanica pentru ruperea celulelor inainte de extractie. Aproximativ 0,5 ml material celular a fost dezghetat si centrifugat la 13.000 G timp de 30 sec intr-un tub de 1,5 ml. Supernatantul a fost indepartat si peletele s-au spalat in 500 μl Milli-Q apa. Acest proces a fost repetat de trei ori inainte ca peleta sa fie transferata intr-un tub curat de 1,5 ml. Peletul a fost apoi suspendat in 200 ui SoluLyse (Genlantis, San Diego, CA) (vezi Hall si colab. [36]) si a fost incubat la temperatura camerei timp de 15 minute. Intregul continut al tubului a fost apoi transferat intr-un tub de margele de 0,7 mm MO BIO (MO BIO Laboratories, Cambridge, Marea Britanie), si cu vortex la putere maxima timp de 5 minute. gDNA a fost apoi extras din lizat folosind coloane de flux de gravitatie Machery-Nagel AXG20 (Machery-Nagel, Duren, Germania) conform protocolului producatorilor (inclusiv etapa optionala de adaugare a lizozimei). Integritatea gDNA cu greutate moleculara mare a fost evaluata folosind imagistica pe gel (1% gel de agaroza 1,5 ore) si cantificata folosind testul QUBIT (Invitrogen, Carlsbad, CA) inainte de a fi trimis pentru secventiere. Pregatirea bibliotecii s-a facut folosind Kitul de pregatire a bibliotecii DNA Illumina TruSeq Nano (Illumina, San Diego, CA), conform instructiunilor producatorilor, cu o distributie medie finala a bibliotecii (inclusiv adaptoare) de 650 CP. Secventializarea a fost facuta folosind Illumina Hi-Seq 2500 (o linie) pentru a genera un total de 83.595.

Array

840 cp de 100 cp insotite de citiri cu o dimensiune de insertie de ~ 600 bp. Datele au fost procesate folosind RTA v1.18.64, cu filtru implicit si setari de calitate. Citirile au fost demultiplexate cu CASAVA v1.8.4 (permitand nepotrivire).

Asamblare

Inainte de a putea fi efectuata analiza genomului, a fost necesara separarea genomului cianobacterian de secventele non-cianobacteriene. Un ansamblu procariotic ideal produs de un asamblator pe baza de grafic de Bruijn, cum ar fi SPAdes [37], ar produce un singur cromozom unde exista o singura cale posibila intre noduri (adica contiguri individuale). Cu toate acestea, ambiguitatile raman adesea intr-un ansamblu (de exemplu, din cauza regiunilor repetate sau a genelor duplicate) care duc la grafice de Bruijn cu muchii multiple (adica posibile alinieri intre contiguri). In timp ce aceste mai multe muchii impiedica formarea unui singur cromozom concludent, ele pot fi folosite pentru a determina relatiile dintre grupurile de contiguri mai mici. In timp ce aceasta informatie este de obicei aruncata, ea poate fi folosita pentru a izola genomii individuali de un metagenom, si validat in cazul in care contigurile pot fi definite simultan prin alte caracteristici comune, cum ar fi profunzimea de citire, asemanarea BLAST sau compozitia secventei. Vizualizarea acestor informatii a fost recent disponibila in vizualizatorul de grafice de Bruijn Bandage [38].

Inainte de asamblare, adaptoarele Illumina TruSeq-3-PE au fost taiate si filtrate pentru calitate folosind Trimmomatic v0.32 [39] folosind urmatorii parametri: Leading: 20, Trailing: 20, SlidingWindow: 4: 20, MinLen: 50. Corectia si asamblarea erorilor a fost facuta folosind SPAdes v3.5.0 [37] cu lungimi k-mer de 67, 77, 87 si 97 si o reducere a acoperirii de 20. Fisierele SPAdes FASTG au fost apoi deschise in Bandage v0.07 [38] si o baza de date BLAST generata pentru intregul ansamblu. Mii cincizeci si patru de grupe cianobacteriene de baza ale grupurilor ortologice de proteine ​​(CyOG-uri de baza) (a se vedea Mulkidjanian si colab. [40], Informatii suplimentare), exclusiv pentru cianobacterii si plastide, au fost cautate in aceasta baza de date folosind tBLASTn v2.2.30 + cu un e -valoarea pragului de 1e-10. Contigoii cianobacterieni au fost identificati ca noduri grafice care contin CyOG-uri de baza si noduri conectate cu o profunzime de citire similara. Nodurile suplimentare neconectate, cu acoperire similara a contigurilor cianobacteriene confirmate, au fost verificate manual prin efectuarea de noi cautari tBLASTn in intreaga baza de date NCBI GenBank (pragul valorii electronice de 1e-10); cele care nu contineau gene cianobacteriene putative au fost aruncate. In cele din urma, contiguri cu adancimea de citire <10 au fost aruncate pentru a indeparta contighele ne-cianobacteriene ramase si contigii cu lungimea <200 bp au fost aruncate pentru a se alinia standardelor NCBI. Citirile brute au fost asortate la ansamblul proiectului rezultat folosind BWA [41]. Citirile care nu corespund ansamblului cianobacterian au fost aruncate, relevand o acoperire generala a Nodurile suplimentare neconectate, cu acoperire similara a contigurilor cianobacteriene confirmate, au fost verificate manual prin efectuarea de noi cautari tBLASTn in intreaga baza de date NCBI GenBank (pragul valorii electronice de 1e-10); cele care nu contineau gene cianobacteriene putative au fost aruncate. In cele din urma, contiguri cu adancimea de citire <10 au fost aruncate pentru a indeparta contighele ne-cianobacteriene ramase si contigii cu lungimea <200 bp au fost aruncate pentru a se alinia standardelor NCBI. Citirile brute au fost asortate la ansamblul proiectului rezultat folosind BWA [41]. Citirile care nu corespund ansamblului cianobacterian au fost aruncate, relevand o acoperire generala a Nodurile suplimentare neconectate, cu acoperire similara a contigilor cianobacterieni confirmati, au fost verificate manual prin efectuarea de cautari tBLASTn ulterioare in intreaga baza de date NCBI GenBank (pragul valorii electronice de 1e-10); cele care nu contineau gene cianobacteriene putative au fost aruncate. In cele din urma, contiguri cu adancimea de citire <10 au fost aruncate pentru a indeparta contighele ne-cianobacteriene ramase si contigii cu lungimea <200 bp au fost aruncate pentru a se alinia standardelor NCBI. Citirile brute au fost asortate la ansamblul proiectului rezultat folosind BWA [41]. Citirile care nu corespund ansamblului cianobacterian au fost aruncate, relevand o acoperire generala a cele care nu contineau gene cianobacteriene putative au fost aruncate. In cele din urma, contiguri cu adancimea de citire <10 au fost aruncate pentru a indeparta contighele ne-cianobacteriene ramase si contigii cu lungimea <200 bp au fost aruncate pentru a se alinia standardelor NCBI. Citirile brute au fost asortate la ansamblul proiectului rezultat folosind BWA [41]. Citirile care nu corespund ansamblului cianobacterian au fost aruncate, relevand o acoperire generala a cele care nu contineau gene cianobacteriene putative au fost aruncate. In cele din urma, contiguri cu adancimea de citire <10 au fost aruncate pentru a indeparta contighele ne-cianobacteriene ramase si contigii cu lungimea <200 bp au fost aruncate pentru a se alinia standardelor NCBI. Citirile brute au fost asortate la ansamblul proiectului rezultat folosind BWA [41]. Citirile care nu corespund ansamblului cianobacterian au fost aruncate, relevand o acoperire generala aGenoma P. sacerdot BC1401 de 340,55 ×.

Proiectul genomului a fost transmis catre JGI IMG / ER [42] pentru adnotare (ID de proiect de analiza GOLD: Ga0078185). Pe baza asemanarii secventei, genomul asamblat a fost aliniat la cel mai apropiat vecin cu un genom finalizat, Leptolygnbya boryana PCC 6306 cu Contiguator v2.7.4 [43] folosind BLASTn cu o valoare electronica de 1e-10, un prag de lungime contig de 1000, un prag de lungime de lovire de 1000 si un prag de acoperire contig de 10%. Identificarea genelor specifice de interes s-a facut folosind BLASTp (pragul valorii e de 1e-5) si cautarile ulterioare pentru domeniile Pfam au fost facute daca cautarile BLAST au dat rezultate ambigue. Aceste analize au fost efectuate folosind instrumentele disponibile in JGI IMG / ER [42].

Pentru a deduce omologia structurala a proteinelor in care anumite domenii au lipsit, genele au fost aliniate in Jalview v2.9.0b2 [44] si structurile proteice modelate folosind portalul web Phyre2 [45].

Parcele de genom au fost produse in Circos v0.68 [46] si diagramele genice au fost realizate folosind FancyGene v1.4 [47]. Toate loturile au fost editate manual folosind Inkscape v0.91 [48].

Acest proiect de arma de arma genom a fost depus la DDBJ / ENA / GenBank sub aderarea LXYR00000000. Versiunea descrisa in aceasta lucrare este versiunea LXYR01000000. Secventa genomului si datele adnotarilor sunt disponibile la baza de date IMG / ER JGI [49].

Analiza filogenetica

A fost construit un set de date SSR rRNA incluzand P. sacerdot BC1401 si alte 130 de genomuri de cianobacterii utilizate de Sanchez-Baracaldo [50]. In plus, secventa de rRNA SSU P. priestleyi ANT.L61.2 [51] a fost inclusa ca referinta pentru o tulpina antarctica de P. priestleyi. O aliniere de 1.712 caractere a fost generata folosind SATe 2.2.7 [52] (folosind MAFFT v6.717 [53], MUSCLE v3.7 [54], FASTTREE v2.1.4 [55] cu aproximarea CAT si strategia de descompunere setata la ‘ cel mai lung „). Reconstructia filogenetica a fost realizata folosind RaxML v8.1.11 [56] folosind modelul GTR + G. Arborele a fost constrans folosind 130 de taxoni filogenomici (135 proteine ​​si doua rRNA: LSU si SSU) arbore descrise in Sanchez-Baracaldo [50]. Copacii au fost vizualizati folosind FigTree v1.4.

Array

0 [57] si editati manual in Inkscape v0.91 [48].

Analizele noastre filogenetice indica faptul ca P. sacerdot BC1401 este sora lui Phormidesmis ANT.L61.2 din vaile uscate McMurdo, Antarctica. Aceste doua linii sunt sora lui L. boryana PCC 6306, Oscillatoriales cyanobacterium JSC-12 si Geitlerinema sp. PCC 7407 (Fig. 1). Aceste tulpini se cuibaresc intr-un grup de linii filamentoase cu diametru celular mic din microcianobacteria [50]. Statisticile genomului si locatiile de esantionare pentru toate genomele complete utilizate in acest studiu sunt prezentate in tabelul 1.

Graficul de Bruijn al intregului ansamblu brut a fost format din 752 noduri cu 439 muchii si o lungime totala de 21.126.715 bp reprezentand un metagenom care contine atat P. sacerdot BC1401 cat si microbiota asociata. Portiunea principala cianobacteriana a graficului a fost determinata ca un grup de 268 noduri legate de 355 muchii (5.524.226 bp) cu o adancime medie de 16,5. Dintre acestia, 49 de noduri cu 3 muchii (3.795.178 CP) si o adancime medie de 14,1 au avut lovituri BLAST pozitive pentru CyOG-uri de baza. Toate accesarile BLAST pentru CyOG-uri de baza au fost continute in portiunea principala cianobacteriana a graficului [a se vedea fisul aditional 1]. Ultimul genom proiectat al P. P. P.leyleyBC1401 a constituit un total de 213 contiguri care contine 5.507 gene care codifica proteine ​​(PEG). Conturile au variat de la 213 la 2.755,82 CP si ansamblul a avut un N50 de 79.760 de baze. Dimensiunea genomului a fost estimata a fi 5,55 Mb, cu un continut total de GC de 49,16%. Marimea genomului secventiat al P. sacerdoti BC1401 a fost gasita a fi mai mica decat cea a rudelor sale cu un genom complet, (identitatea genei SSR rRNA = 92%) L. boryana PCC 6306 (marime = 7,26 Mb, GC = 47,01%) , cu un continut de GC putin mai mare. In ciuda dimensiunii mai mici in raport cu L. boryana PCC 6306, toate 1.054 CyOG-uri de baza au fost prezente in proiectul genomului P. sacerdot BC1401 sugerand un ansamblu aproape complet. Optzeci si cinci de contiguri au fost mapate cu succesL. boryana PCC 6306 (4,77 Mb, 85,97% din totalul genomului proiectat) (Fig. 2) lasand 128 contiguri mai mici (0,78 Mb, 14,03% din totalul genomului total) neimpediate. Un complot care afiseaza toti contigii nemodificati poate fi vazut in fisierul suplimentar 2. Patruzeci si cinci dintre acesti contiguri aveau o lungime sub 1.000 CP si 77 au fost renuntati la aliniere din cauza acoperirii reduse.

Adaptare la rece

Evolutia moleculara legata de adaptarea la frig poate lasa semnaturi distincte pe genomii organismului (de exemplu, Bacterii: Psychrobacter arcticus 273–4 [58], Colwellia psychrerythraea 34H [59]; Archaea: Halobrum lacusprofundi [60], Methanogenium frigidum si Methanococcoides burtonii[61]. In special, tendinta anumitor aminoacizi de a influenta structurile proteice la temperaturi scazute poate duce la substituirea unui aminoacid cu altul. De exemplu, aminoacidul arginina formeaza cu usurinta legaturi H in structurile secundare proteice; in medii cu temperaturi scazute, acest lucru poate inhiba flexibilitatea proteinelor si poate preveni functionarea optima a proteinei. Ca atare, organismele adaptate la rece pot substitui reziduurile de arginina cu lizina pentru a reduce stabilitatea structurala la temperaturi scazute, asa cum se vede in Alteromonas haloplanctis [62]. In mod similar, o reducere a continutului de prolina poate creste, de asemenea, flexibilitatea structurii secundare a unei proteine ​​[63, 64] (de exemplu, Psychrobacter immobilis A5 [65]). Procentul reziduurilor proline din proteomul ipotetic al P. sacerdotiBC1401 (Pro% = 4,76) a fost similar cu cel al L. boryana PCC 6306 (Pro% = 4,66) si Oscillatoriales cyanobacterium JSC-12 (Pro% = 4,78) si a fost putin mai mare in Geitlerinema sp. PCC 7407 (Pro% = 5,44). Raportul arginina la lizina in BC1401 (Arg: Lys = 1,4) a fost, de asemenea, comparabil cu PCC 6306 (Arg: Lys = 1,45) si JSC-12 (Arg: Lys = 1,49), in timp ce a fost putin mai mare in PCC 7404 (Arg: Lys = 2,22). Avand in vedere intervalele mari de temperatura experimentate de fiecare dintre aceste tulpini (tabelul 1), se pare ca nu exista semnal evident de adaptare genomica crescuta la frig in BC1401 in comparatie cu alte cianobacterii intalnite in mod obisnuit in habitatele mai calde.

Stresul la temperatura din bacterii este gestionat prin mecanisme de soc rece sau de soc termic, care permit celulelor sa functioneze la temperaturi scazute sau sa supravietuiasca peste nivelul lor optim termic. In bacterii, au fost identificate numeroase gene care codifica proteine ​​legate de raspunsurile celulare la stresul rece (de exemplu, piruvat dehidrogenaze, girale ADN, chaperone si desaturasele acizilor grasi) [5, 66]. Mai multe proteine ​​implicate in socul rece actioneaza, de asemenea, ca proteine ​​de soc termic. Deoarece optimul fiziologic al fototrofelor crioconitului este peste cel intalnit in mediul inconjurator [67], stresul rece este probabil foarte important in P. priestleyi BC1401. Cu toate acestea, daca organismele sunt obisnuite sa creasca la temperaturi scazute, atunci in caz de incalzire brusca, poate aparea un raspuns la stres la caldura. Numerele de accesari BLAST inGenomul P. sacerdot BC1401 pentru gene implicate in raspunsul la soc la rece, comparativ cu cele trei rude apropiate cu genomuri complete ( Leptolyngbya boryana PCC 6306, Oscillatoriales cyanobacterium JSC-12 si Geitlerinema sp. PCC 7407) sunt prezentate in tabelul 2. Toate genele enumerate au fost prezentate prezent la toate genomele, cu exceptia urmatoarelor: genele csp -familia au lipsit de la Oscillatoriales cyanobacterium JSC-12, ot A a fost gasit doar in Geitlerinema sp. PCC7407, iar yfiaA a lipsit de la L. boryana PCC6306. In caz contrar, variatia numarului de copii intre cei patru genomi a fost minima, fara o crestere clara a genelor de stres receP. sacerdotii BC1401. Aceasta a inclus genele pentru chaperone care sunt, de asemenea, implicate in raspunsul la socul termic ( dnaK , dnaJ ) si nu s-a gasit nicio diferenta in numarul de copii dintre genomii cianobacterieni comparati pentru gena specifica socului termic grpE [68].

• escorte cv www.pornograph.jp
• escorte pitsti www.travelinscotland.com
• escorte testate cluj active.ws
• escorte care inghit reliablesoftware.com
• escorte dej judetul cluj vxn.cadenaunionradio.com
• escorte mature din braila forum.egcommunity.it

Chiar si asa, este posibil ca in prezent genele necaracterizate implicate in toleranta la frig (de exemplu, productia de proteine ​​de nucleare de gheata sau rezistenta la stresul osmotic [69]) sa ramana inca neidentificate in genomul P. sacerdot BC1401.

Absenta aparenta de diferentiere a genelor de soc rece intre P. sacerdot BC1401 si lineajele temperate ar putea fi legata de tendinta cianobacteriilor polare de a fi psicrotrofe, mai degraba decat de psihofile, care prezinta o crestere optima la temperaturi mult mai ridicate decat temperaturile medii scazute la care sunt susceptibile sa experienta in mediu [70]. Avand in vedere acest lucru, s-ar putea ca mecanisme mai universale, cum ar fi productia de EPS sa fie responsabile pentru succesul cianobacteriilor in medii reci.

Mecanisme de productie EPS in P. sacerdot BC1401

Desi nu sunt pe deplin caracterizate experimental in cianobacterii, genele responsabile pentru biosinteza EPS si exportul in cianobacterii au fost clar conturate in Pereira si colab. [71]. Aceste gene codifica proteinele constitutive ale mai multor cai specifice din bacteriile gram-negative care au fost initial studiate in E. coli (analizate in Cuthbertson si colab. [72]). In sectiunile urmatoare, raportam distributia acestor gene pe intregul genom al P. P. P. P.leyley BC1401.

Productia de EPS procariote in interiorul celulei are loc de obicei in trei etape principale [15]. In primul rand, oligozaharidele sunt sintetizate in citoplasma. In al doilea rand, unitatile repetante ale oligozaharidelor sunt asamblate si atasate la un purtator de lipide de catre glicoziltransferaze. In cele din urma, unitatile care se repeta sunt polimerizate si translocate din celula. Aceasta etapa finala este realizata de unul dintre cele trei sisteme principale: caile dependente de Wzy, dependente de ATP (ABC) – dependente de sinteza si cai dependente de sintaza [16, 64, 73].

In calea dependenta de Wzy, unitatile de oligozaharide legate de lipide sunt translocate de la citoplasma la periplasm de Wzx unde sunt polimerizate de Wzy. Exportul are loc apoi prin intermediul polimacharidelor transmembranare co-polimeraza (PCP) Wzc si al transportorului de membrana externa (OPX) Wza. Doua clustere de gene din P. sacerdot BC1401 au urmat schema pentru un sistem de export EPS-dependent Wzy, unul pe contig Ga0079976_1029 si un altul pe Ga0079976_1013 (Fig. 3a). Ambele clustere au inclus gene care contin domenii care sunt conservate in genele wza, wzc, wzx si wzy . In ambele clustere, wza si wzcerau adiacente intre ele, in timp ce dispunerea celorlalte gene asociate difera considerabil. Ambele clustere au inclus gene care contin domenii implicate in biosinteza (domenii WcaA) si asamblare (glicoziltransferaze, domenii RfaB). Doua gene din clusterul de pe contig Ga0079976_1013 sunt adnotate in mod putativ ca exotosine, a carui domeniu glucuronosiltransferaza s-a dovedit a fi omolog cu gena mur 3 din Arabidopsis thaliana [74]. mur 3 este responsabil pentru modificarea xiloglucanilor (implicate in reticularea matricilor celulozelor), iar genele gasite aici pot codifica proteine ​​responsabile de functii similare care contribuie la structura matricei EPS.

In calea dependenta de ABC, polimerizarea are loc in citoplasma, iar transportatorul ABC KpsTM transfera polizaharidele asamblate pe membrana citoplasmatica, inainte de a fi exportate din celula de proteinele PCP / OPX KpsD si KpsE. Doua clustere din P. priestleyi BC1401 au continut componente pentru calea dependenta de ABC (Fig. 3b). Grupurile de gene de pe contigurile Ga0079976_1005 si Ga0079976_1008 contin gene cu domenii gasite in kpsD , kpsE , kpsM si kpsT . Pe contig Ga0079976_1005, kpsM a fost adnotat ca doua gene mai mici si toate genele kps _ au fost grupate strans intre ele, in timp ce pe Ga0079976_1008 kpsD sikpsE au fost localizate ~ 80kbp amonte de kpsM si kpsT Omologii. Ca si in cazul grupurilor W-dependente, mai multe gene biosintetice si de asamblare au fost, de asemenea, prezente, ceea ce sugereaza module de sine statatoare pentru sinteza EPS si export in P. sacerdot BC1401.

In calea dependenta de sintaza, o singura proteina, Alg8 (care este reglementata de Alg44) realizeaza sinteza, polimerizarea si translocarea de la citoplasma la periplasm. Exportul se realizeaza printr-o porina de membrana exterioara, AlgE, care este esafodata pe membrana de catre AlgK. Cu toate ca s-au gasit mai multi omologi alg8 in genom, nu s-au identificat cai clare dependente de sintaza in P. sacerdoti BC1401. Acest lucru este in concordanta cu concluziile lui Peireira si colab. [71] care nu au putut identifica in mod increzator componentele cheie ale caii dependente de sintaza pe intregul filon al cianobacteriilor.

Din caile de export procariotice EPS cunoscute, P. sacerdot BC1401 continea doua clustere de gene dependente de Wzy si doua ABC si nu exista clustere de gene dependente de sintaza completa, similare cu multe alte cianobacterii indiferent de mediu [71]. In ciuda importantei productiei de EPS pentru supravietuirea in medii reci, nu a existat niciun indiciu ca genomul P. sacerdotii BC1401 a avut o crestere relativa a genelor legate de EPS. Genele EPS sunt cuprinse in grupul de gene ortologice (COG) din categoria „Perete celular / membrana / biogeneza plic”. Un total de 225 de gene reprezentand 7,61% din genomul P. sacerdot BC1401 au fost incluse in categoria „Biogeneza peretelui celular / membranei / plicului” (vezi Fig. 4a), comparativ cu 6,91% in L. boryanaPCC 6306, 7,17% in cianobacteriul Oscillatoriales JSC-12 si 8,05% in Geitlerinema sp. PCC 7407. Peireira si colab. [71] a indicat ca dimensiunea genomului, mai degraba decat habitatul, a avut cel mai mare efect asupra numarului de gene asociate EPS. P. sacerdotii BC1401 par sa nu faca exceptie de la acest lucru, cu numarul de gene „perete celular / membrana / biogeneza invelis” care se incadreaza bine in distributia preconizata a genomilor de dimensiunea respectiva (vezi Fig. 4b).

Detectarea mediului

Desi este clar ca multe cianobacterii produc EPS, modul in care productia EPS este reglementata in cianobacterii nu este inca inteles. Al doilea mesager bacterian bis (3′-5 ′) – monofosfat dimeric de guanozina ciclica (c-di-GMP) a fost implicat intr-un numar mare de cai de semnalizare legate de biosinteza EPS si formarea biofilmului [75, 76]. Este sintetizat de proteine ​​care contin domeniul GGDEF / GGEEF conservat si se leaga la o mare varietate de receptori celulari, care sunt in mod normal proteine ​​care contin domenii PilZ. Sinteza c-di-GMP poate fi reglementata de sistemul Wsp (identificat mai intai in Pseudomonas fluorescens), o cale chimio-senzoriala gandita sa moduleze nivelurile c-di-GMP ca raspuns la aderenta de suprafata care provoaca formarea de biofilm si o tranzitie de la stilul de viata motil la sesil [77-79]. O caseta aproape completa pentru calea chimosenzoriala Wsp a fost gasita in P. sacerdot BC1401, localizata pe contig Ga0079976_1038 (Fig. 5). O gena pentru o proteina de legare a nucleotidelor ciclice este urmata pe catena anterioara de wspB , wspC , wspA , wspD , wspE , wspF . In pozitia ocupata in mod normal de regulatorul de raspuns WspRa fost un ciclu de adenilat de clasa 3. In timp ce WspR este un domeniu GGDEF / GGEEF care contine dicanilat ciclaza, clasa a 3-a adenilat ciclazele sunt un domeniu de omologie al ciclazei care contine mononucleotidilciclaze. Cautarile pentru domeniile pfam GGDEF / GGEEF din genomul P. sacerdot BC1401 au evidentiat sase potentiali omologi wspR . Modelarea in silico a structurilor lor folosind Phyre2 a relevat doua proteine ​​care prezinta omologie la WspR cu 100% incredere pe o lungime de aliniere> 90% (Tabelul 3, Fig. 6). Una dintre acestea este o singura gena pe contig Ga0079976_1021, iar a doua este pe contig Ga0079976_1062. Alte cinci gene au continut domenii GGDEF / GGEEF, dar au prezentat o similaritate scazuta a secventei pentru restul proteinei (tabelul 3).

Pentru un sistem WspR standard reglat de WspR pentru a influenta productia de EPS si formarea de biofilm, trebuie sa existe un receptor pentru c-di-GMP sintetizat. Oarecum pe neasteptate, genele care contin domeniile PilZ tipic de legare c-di-GMP tipice erau aparent absente de la proiectul genomului P. sacerdot BC1401. Cautarile Blast pentru omologi ai genei pentru Alg44, componenta de legare c-di-GMP a caii dependente de sintaza absenta, au relevat 14 gene care au impartit domeniul HlyD al alg44in timp ce domeniul PilZ parea sa lipseasca (tabelul 4). Cinci dintre acestea au fost grupate impreuna cu genele ABC-transporter; Un astfel de grup a fost omolog cu DevBCA, transportorul efluxului responsabil de formarea plicului heterocist in cianobacterii diazotrofice [80, 81]. Trebuie subliniat faptul ca transportorii ABC sunt implicati intr-o mare varietate de procese celulare si nu sunt neaparat legate de EPS. Alte gene au fost, de asemenea, implicate in legarea c-di-GMP. De exemplu, domeniile GZDEF / GGEEF non-enzimatice (de exemplu, PopA si PelD) s-au dovedit ca functioneaza ca efectori c-di-GMP [72]. Cel putin o astfel de proteina poate exista in P. sacerdotiBC1401 unde a fost identificat un domeniu GGDEF / GGEEF, insa motivul GGDEF / GGEEF in sine a absentat (Ga0079976_10297). Cu toate acestea, in ciuda existentei clare a unui sistem chemosensorial bine definit ca Wsp, natura exacta a regulatorilor si efectoarelor de raspuns ale sistemului ramane neclara. Asemanarea stransa a genelor Wsp din P. priestleyi BC1401 cu cele din cateva alte cianobacterii sugereaza ca aceasta poate fi o cale importanta de-a lungul cianobacteriilor si necesita investigatii suplimentare daca trebuie sa intelegem modul in care cianobacteriile interactioneaza cu mediul lor.

Mecanismele de producere si reglare a EPS descrise aici nu sunt in niciun caz unice pentru P. sacerdot BC1401 si pot fi gasite in intregul filon cianobacterian [71]. Cu toate acestea, ele nu sunt, de asemenea, omniprezente si caracteristicile specifice de linie pot insemna ca anumite cianobacterii sunt predispuse sa exploateze anumite medii sau sa interactioneze cu mediul lor in moduri particulare. De exemplu, sistemul Wsp nu este prezent in toate cianobacteriile, fiind identificat in L. boryana PCC 6306 si Geitlerinema sp. PCC 7407, dar nu in Osanculatoriales cyanobacterium JSC-12. Aceasta implica faptul ca liniile strans legate pot interactiona cu mediul lor in moduri foarte diferite. In termeni de P. priestleyiBC1401, prezenta sistemului Wsp poate avea implicatii considerabile asupra mecanismelor de formare a crioconitelor. Contactul fizic al suprafetei celulare a P. sacerdotului cu particule poate duce la activarea formarii biofilmului si a mecanismelor de productie EPS, initizand astfel primele etape ale agregarii crioconitei. Cercetarile ulterioare privind reglementarea si expresia acestui mecanism si a mecanismelor de productie EPS ne vor ajuta sa intelegem cum cianobacteriile influenteaza suprafetele straturilor de gheata.

Multumim Jane Coghill si Christy Waterfall la Bristol Genomics Facility, Annette Richer pentru ajutor in cultura, Karen Cameron pentru asistenta in teren, Marek Stibal si Jason Box pentru facilitarea lucrarilor de camp pe gheata din Groenlanda. Nu a fost necesara permisiunea pentru colectarea esantioanelor utilizate in acest studiu.

Finantarea

Aceasta cercetare a fost realizata ca parte a Parteneriatului de formare doctorala NERC GW4 + din Bristol, care sprijina NAMC. Sprijinul pentru finantare pentru aceasta lucrare a venit dintr-o subventie NERC (NE / J02399X / 1) acordata AMA si unei Societati Regale Dorothy Hodgkin Fellowship pentru PS-B.

Disponibilitatea datelor si a materialelor

Acest proiect de arma de arma genom a fost